革兰氏染色法是细菌学中重要的鉴别染色法，通过此法染色，可将细菌鉴别为革兰氏阳性菌（G）和革兰氏阴性菌（G-）两大类。以下是革兰氏染色的注意事项：

1. 涂片：取洁净载玻片一张，用玻璃铅笔于玻片上划个直径1.5cm左右的圆圈。用接种环在圆圈内各加1环生理盐水。接种环灭菌后，挑取细菌少许在盐水中磨匀，呈轻度混浊。涂好的菌膜大小一般以1cm²左右为宜。每次取菌前后注意将接种环灭菌。如果是液体培养物可直接涂抹于洁净的载玻片上。

2. 干燥：涂片最好在室温下自然干燥，或将标本面向上，置于酒精灯火焰高处慢慢烘干，切不可在火焰上烧干。

3. 固定：细菌的固定常用火焰加热法，即将上述已干的涂片在酒精灯火焰中通过3次。固定的目的在于杀死细菌，并使菌体与玻片粘附牢固，染色时不致于被染液和水冲掉，同时固定可凝固细胞质，改变细菌对染料的通透性。

4. 初染：将结晶紫染液加于制好的涂片上，染色1min，用细流水冲洗，甩去积水。

5. 媒染：加卢戈碘液作用1min，用细流水冲洗，甩去积水。

6. 脱色：滴加95%酒精数滴，摇动玻片数秒钟，使均匀脱色，然后斜持玻片，再滴加酒精，直到流下的酒精无色为止（约0.5min），用细流水冲洗，甩去积水。

7. 复染：加稀释石炭酸复红染0.5min，用细流水冲洗，甩去积水。

在进行革兰氏染色实验时，应选择活跃性较强的菌种，涂片不宜过厚，脱色要完全，不可不够或者过度。这些注意事项有助于保证染色的质量。