印迹杂交技术，包括Northern和Southern两种形式，是RNA和DNA分析中常用的实验手段。与Southern印迹相似，Northern印迹的准备步骤中，RNA先通过甲基氢氧化银、乙二醛或甲醛变性，而非NaOH，因为NaOH会水解RNA的2'-羟基基团。变性后的RNA更易在硝酸纤维素膜上吸附，但需在高盐条件下进行转印，转印后需用低盐缓冲液洗脱以防止RNA丢失。操作中避免使用EB，因为它会影响RNA膜结合。为了测定片段大小，可在同一胶片上添加分子量标记物进行电泳，然后切割、染色并照相。标记物的染色需在暗室中进行，避免过多紫外线暴露，以防信号降低。在琼脂糖凝胶中，甲醛常被用作RNA的可逆变性剂，尽管有毒，因其效果显著。在整个过程中，需严格防止RNase污染。以下是具体步骤：

1. 在40ml水中溶解7g琼脂糖，冷却至60℃后，加入10×MSE缓冲液、甲醛和水，制成凝胶液。

2. 等凝胶凝固后，移除工具，将凝胶放入1×MSE缓冲液电泳槽。

3. RNA变性：取4.5ml RNA、20ml 10×MSE缓冲液、3.5ml甲醛和10ml去离子甲酰胺，55℃加热15分钟，冷却后加5×载样缓冲液。

4. 进行电泳，电压为60伏，持续过夜。

5. 洗涤凝胶，先用20×SSC浸泡两次，每次5分钟。

6. 用50mmol/L NaOH和10mmol/L NaCl溶液水解高分子RNA，增强转印效果，然后用0.1mmol/L Tris HCl（pH7.5）中和胶液。

7. 最后，在20×SSC中过夜转印至硝酸纤维素膜，并在80℃真空烘烤2小时。

扩展资料

在基因操作中，把DNA或RNA、蛋白质等在薄膜滤器上先经浸润，固定后，于薄膜滤器上进行杂交，生成杂种分子。为基因操作中最常用的技术。