色谱定量方法：标准加入法&内标法&外标法！

色谱分析中，对样品进行定量是关键步骤。定量依据组分的重量或在载气中的浓度与检测器的响应信号正相关。定量分析方法包含面积归一化法、内标法、外标法等。本文旨在区分内标法、外标法。

内标法涉及选择与待测组分相似但完全分离的组分作为内标物，配制待测组分与内标物的混合标准溶液，通过相对校正因子计算待测组分的定量参数。将内标物加入待测样品中，测定待测组分与内标物的定量参数，使用内标法公式计算结果。

外标法是利用标准品的峰面积或峰高与其对应浓度绘制标准曲线，测量样品的峰面积或峰高，通过标准曲线查找对应的浓度。这是最常用的定量方法，但有时很难保证样品与标准品进样体积一致。内标法则在外标法基础上，加入一种物质，通过该物质峰面积或峰高的变化，了解进样体积差异，但同时引入秤量误差。外标法适用于样品与标准品体积控制较好的情况，内标法则适用于体积难以精确控制的场景。

外标法（标准曲线法、直接比较法）首先绘制标准工作曲线，用标准样品配制不同浓度标准系列，以与待测组分相同的色谱条件进样，测量各峰的峰面积或峰高，绘制标准工作曲线，此曲线通常应通过原点。若曲线不通过原点，表明方法存在系统误差。斜率即绝对校正因子。

当待测组分含量变化不大，且已知其大致含量时，可使用单点校正法，直接比较法定量。这种方法利用原点作为标准工作曲线上的另一个点，方法存在系统误差时，单点校正法误差较大。规定斜率y=ax+b中，b的绝对值应不超过100%响应值的2%。

标准曲线法优点是绘制曲线后测定工作简单，计算直接从曲线上读取含量，适合大量样品分析。但每次样品分析的色谱条件难相同，易出现误差。标准工作曲线绘制时，一般使用待测组分的标准样品，无法补偿样品前处理过程中待测组分变化。

内标法选择适宜物质作为待测组分参比物，定量加入样品中，依据待测组分和参比物响应值之比及参比物加入量进行定量分析。内标法关键在于选择合适的内标物。

内标法优点是进样量变化和色谱条件微小变化对结果影响不大，前处理前加入内标物，可部分补偿待测组分损失。若需高精度结果，可加入多种内标物。内标法较标准曲线法更准确和精确。

标准加入法实质上是特殊内标法，选择待测组分纯物质作为内标物，加入待测样品中，测定待测组分纯物质前后峰面积或峰高，计算样品中待测组分含量。标准加入法优点是操作简单，无需精确进样量。若在样品前处理前加入已知量的待测组分，可完全补偿损失。

标准加入法缺点是色谱条件需完全相同，否则造成分析误差。选择内标物时需考虑四个要求：纯物质、溶于样品、完全分离、与待测组分色谱峰相近。

内标法优点是测定结果较为准确，通过内标物与待测组分峰面积相对值计算，一定程度上消除操作条件变化引起的误差。缺点是操作程序繁琐，每次分析需准确称量内标物和试样。

外标法操作简便，但进样量需严格控制，必须在相同操作条件下进行，否则影响分析结果。内标法与外标法是定量分析的不同方法，选择哪一种取决于分析要求、成本和效率。

何时添加内标需考虑样品制备过程中的损失。在某些应用中，内标应早添加，而在其他应用中，可能在稍后阶段添加。选择非同位素标记的内标时需考虑内标物的溶解性、与样品组分的分离、添加量和色谱峰位置。

使用同位素标记的内标时需谨慎，选择13C 和 15N 标记化合物常优于氘标记化合物，因保留时间偏移较小，目标化合物与内标在基质抑制和增强方面的差异较小。

内标法与外标法各有优势和局限性，具体选择需根据分析目标、成本、效率和实验室条件。方法验证和确认对于任何定量分析方法都很重要。