血糖水平对胰岛素分泌的调控至关重要。当血糖上升时，胰岛素的分泌会迅速增加，帮助降低血糖。这种反应在高血糖刺激下呈现三个阶段：首先，在血糖升高5分钟内，胰岛素分泌增加约10倍，主要由储存的激素释放引起，因此持续时间短暂；随后，15分钟后出现第二次胰岛素分泌增加，这一阶段分泌量更大且持续时间更长，主要是由于激活了胰岛素合成酶系，促进了胰岛素的合成与释放；若高血糖持续一周左右，胰岛素分泌进一步增加，这可能是因为长时间的高血糖刺激导致B细胞增生。

多种氨基酸和脂肪酸也能刺激胰岛素分泌。精氨酸和赖氨酸的作用尤为显著。即使在血糖正常的情况下，氨基酸的增加只会轻微刺激胰岛素分泌，但若在血糖升高时，过量氨基酸可使胰岛素分泌加倍。此外，大量脂肪酸和酮体的增加也能促进胰岛素的分泌。

多种激素也会影响胰岛素的分泌。胃肠激素如胃泌素、促胰液素、胆囊收缩素和抑胃肽均能促进胰岛素分泌。生长素、皮质醇、甲状腺激素以及胰高血糖素通过提高血糖间接刺激胰岛素分泌，长期大剂量使用这些激素可能损害B细胞，导致糖尿病。胰岛D细胞分泌的生长抑素可以通过旁分泌作用抑制胰岛素和胰高血糖素的分泌，而胰高血糖素则直接刺激B细胞分泌胰岛素。

神经系统也参与调节胰岛素的分泌。胰岛受迷走神经与交感神经的支配。迷走神经通过乙酰胆碱作用于M受体，直接促进胰岛素分泌；同时，它还能通过刺激胃肠激素的释放间接促进胰岛素分泌。相反，交感神经兴奋时，通过去甲肾上腺素作用于α2受体，抑制胰岛素分泌。