酶促法是研究酶活性和催化反应的重要手段,主要包括三种方法:定时法、连续监测法和平衡法。
定时法,又称为两点法,通过测定酶反应开始后某一时间段内产物或底物浓度的总变化量来求取酶反应初速度。其中t1往往取反应开始的时间。反应在一定温度下进行一段固定时间后,通过加入强酸、强碱、蛋白沉淀剂等停止反应,测定底物或产物的变化。这种方法的优点在于操作简单,试剂要求不高,但难以保证结果的真实性,并且难以确定反应时间段酶促反应是否处于线性期。随着保温时间的延续,酶变性失活加速。
连续监测法,又称为动力学法或速率法、连续反应法,在酶反应过程中,用仪器监测产物或底物浓度随时间的变化,通过计算求出酶反应初速度。这种方法更准确,因为它可以根据连续测得的数据选择线性期的底物或产物变化速率用于计算酶活力。在实际工作中,采用工具酶的酶偶联法已成为应用最广、最频繁测酶活性浓度的方法。
平衡法,又称为终点法,通过测定酶反应开始至反应达到平衡时产物或底物浓度总变化量来求出酶活力。这种方法通过计算平衡状态下的产物或底物浓度来确定酶活力,相比于其他方法,平衡法可能需要更长的反应时间以达到平衡状态,但其结果通常更为准确。
这三种酶促法各有利弊,选择哪种方法取决于实验的具体需求、目标和条件。在进行酶活性测定时,正确选择和应用酶促法,对于获得准确、可靠的结果至关重要。